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光学显微镜的工作原理
  • 发布日期:2019-06-20      浏览次数:513
    • 显微镜是一种精密的光学仪器,已有300多年的发展史。自从有了显微镜,人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。目前,不仅有能放大千余倍的光学显微镜,而且有放大几十万倍的电子显微镜,使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。在普通中学生物教学大纲中规定的实验中,大部分要通过显微镜来完成,因此,显微镜性能的好坏是做好观察实验的关键。

      一、显微镜的光学系统

      显微镜的光学系统主要包括物镜、目镜、反光镜和聚光器四个部件。广义的说也包括照明光源、滤光器、盖玻片和载玻片等。

      (一)、物镜

      物镜是决定显微镜性能的zui重要部件,安装在物镜转换器上,接近被观察的物体,故叫做物镜或接物镜。

      1、物镜的分类

      物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜;其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜(常用放大倍数为90100倍)。

      根据放大倍数的不同可分为 低倍物镜(10倍以下)、中倍物镜(20倍左右)高倍物镜(4065倍)。

      根据像差矫正情况,分为消色差物镜(常用,能矫正光谱中两种色光的色差的物镜)和复色差物镜(能矫正光谱中三种色光的色差的物镜,价格贵,使用少)。

      2、物镜的主要参数:

      物镜主要参数包括:放大倍数、数值孔径和工作距离。

      ①、放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例:放大倍数为100×,指的是长度是1μm的标本,放大后像的长度是100μm,要是以面积计算,则放大了10,000倍。

      显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

      ②、数值孔径也叫镜口率,简写NA A,是物镜和聚光器的主要参数,与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05-0.95,油浸物镜(香柏油)的数值孔径为1.25

      ③、工作距离是指当所观察的标本zui清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关,物镜的焦距越长,放大倍数越低,其工作距离越长。例:10倍物镜上标有10/0.25160/0.17,其中10为物镜的放大倍数;0.25为数值孔径;160为镜筒长度(单位mm);0.17为盖玻片的标准厚度(单位 mm)。10倍物镜有效工作距离为6.5mm40倍物镜有效工作距离为0.48mm 。

      3、物镜的作用是将标本作次放大,它是决定显微镜性能的zui重要的部件——分辨力的高低。

      分辨力也叫分辨率或分辨本领。分辨力的大小是用分辨距离(所能分辨开的两个物点间的zui小距离)的数值来表示的。在明视距离(25cm)之处,正常人眼所能看清相距0.073mm的两个物点,这个0.073mm的数值,即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小,即表示它的分辨力越高,也就是表示它的性能越好。

      显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的,而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。

      当用普通的中央照明法(使光线均匀地透过标本的明视照明法)时,显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA

      式中d——物镜的分辨距离,单位 nm。

      λ——照明光线波长,单位 nm

      NA ——物镜的数值孔径

      例如油浸物镜的数值孔径为1.25,可见光波长范围为400700nm ,取其平均波长550 nm,则d=270 nm,约等于照明光线波长一半。一般地,用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm

      (二)、目镜

      因为它靠近观察者的眼睛,因此也叫接目镜。安装在镜筒的上端。

      1、目镜的结构

      通常目镜由上下两组透镜组成,上面的透镜叫做接目透镜,下面的透镜叫做会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑(它的大小决定了视场的大小),因为标本正好在光阑面上成像,可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针,用来指示某个特点的目标。也可在其上面放置目镜测微尺,用来测量所观察标本的大小。

      目镜的长度越短,放大倍数越大(因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比)。

      2、目镜的作用

      是将已被物镜放大的,分辨清晰的实像进一步放大,达到人眼能容易分辨清楚的程度。

      常用目镜的放大倍数为516倍。

      3、目镜与物镜的关系

      物镜已经分辨清楚的细微结构,假如没有经过目镜的再放大,达不到人眼所能分辨的大小,那就看不清楚;但物镜所不能分辨的细微结构,虽然经过高倍目镜的再放大,也还是看不清楚,所以目镜只能起放大作用,不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点,但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离,还是无法看清。所以,目镜和物镜即相互联系,又彼此制约。

      (三)、聚光器

      聚光器也叫集光器。位于标本下方的聚光器支架上。它主要由聚光镜和可变光阑组成。其中,聚光镜可分为明视场聚光镜(普通显微镜配置)和暗视场聚光镜。

      1、光镜的主要参数

      数值孔径(NA )是聚光镜的主要参数,zui大数值孔径一般是1.21.4,数值孔径有一定的可变范围,通常刻在上方透镜边框上的数字是代表zui大的数值孔径,通过调节下部可变光阑的开放程度,可得到此数字以下的各种不同的数值孔径,以适应不同物镜的需要。有的聚光镜由几组透镜组成,zui上面的一组透镜可以卸掉或移出光路,使聚光镜的数值孔径变小,以适应低倍物镜观察时的照明。

      2、聚光镜的作用

      聚光镜的作用相当于凸透镜,起会聚光线的作用,以增强标本的照明。一般地把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处。(聚光焦点正在所要观察的标本上,载玻片的厚度为1.1mm左右)

      3、可变光阑

      可变光阑也叫光圈,位于聚光镜的下方,由十几张金属薄片组成,中心部分形成圆孔。其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光阑开得越大,数值孔径越大(观察完毕后,应将光圈调至zui大)。

      在可变光阑下面,还有一个圆形的滤光片托架。

      说明:在中学实验室只有教师用显微镜(1600×或1500×)才配有聚光器,学生用显微镜(640×或500×)配的是旋转光栏。紧贴在载物台下,能做圆周转动的圆盘,旋转光栏(也称为遮光器),光栏上有大小不等的圆孔,叫光圈。直径分别为2361216mm,转动旋转光栏,光栏上每个光圈都可以对正通光孔,通过大小不等的光圈来调节光线的强弱。

      (四)反光镜

      反光镜是一个可以随意转动的双面镜,直径为50mm,一面为平面,一面为凹面,其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来。平面镜反射光线的能力较弱,是在光线较强时使用,凹面镜反射光线的能力较强,是在光线较弱时使用。

      反光镜通常一面是平面镜,另一面是凹面镜,装在聚光器下面,可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。

      反光镜的作用是使由光源发出的光线或天然光射向聚光器。当用聚光器时一般用平面镜,不用时用凹面镜;当光线强时用平面镜,弱时用凹面镜。

      观察完毕后,应将反光镜垂直放置。

      (五)照明光源

      显微镜的照明可以用天然光源或人工光源

      1、天然光源

      光线来自天空,zui好是由白云反射来的。不可利用直接照来的太阳光。

      2、人工光源

      ①、对人工光源的基本要求:有足够的发光强度;光源发热不能过多。

      ②、常用的人工光源:显微镜灯;日光灯

      (六)滤光器

      安装在光源和聚光器之间。作用是让所选择的某一波段的光线通过,而吸收掉其他的光线,即为了改变光线的光谱成分或削弱光的强度。分为两大类:滤光片和液体滤光器。

      (七)盖玻片和载玻片

      盖玻片和载玻片的表面应相当平坦,无气泡,无划痕。zui好选用无色,透明度好的,使用前应洗净。

      盖玻片的标准厚度是0.17±0.02mm,如不用盖玻片或盖玻片厚度不合适,都回影响成像质量。

      载玻片的标准厚度是1.1±0.04mm,一般可用范围是11.2mm,若太厚会影响聚光器效能,太薄则容易破裂。

      二、显微镜的机械装置

      显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头,固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置组成。

      (一)、镜座和镜臂

      1、镜座 作用是支撑整个显微镜,装有反光镜,有的还装有照明光源。

      2、镜臂 作用是支撑镜筒和载物台。分固定、可倾斜两种。

      (二)、载物台(又称工作台、镜台)

      载物台作用是安放载玻片,形状有圆形和方形两种,其中方形的面积为120mm×110mm。中心有一个通光孔,通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺,一般读数为0.1mm,游标尺可用来测定标本的大小,也可用来对被检部分做标记。

      (三)、镜筒

      镜筒上端放置目镜,下端连接物镜转换器。分为固定式和可调节式两种。机械筒长(从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长)不能变更的叫做固定式镜筒,能变更的叫做调节式镜筒,新式显微镜大多采用固定式镜筒,国产显微镜也大多采用固定式镜筒,国产显微镜的机械筒长通常是160mm

      安装目镜的镜筒,有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种,双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜,两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节,而且其中有一个目镜有屈光度调节(即视力调节)装置,便于两眼视力不同的观察者使用。

      (四)、物镜转换器

      物镜转换器固定在镜筒下端,有34个物镜螺旋口,物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时,应用手指捏住旋转碟旋转,不要用手指推动物镜,因时间长容易使光轴歪斜,使成像质量边坏。

      (五)、调焦装置

      显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋。有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一轴上,大螺旋为粗准焦螺旋,小螺旋为细准焦螺旋;有的则分开安置,位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋,其转动一周,镜筒上升或下降10mm 位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋,其转动一周,镜筒升降值为0.1mm,细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm

      三、显微镜及其部件的使用

      1、使用单筒显微镜时,要养成用左眼观察的习惯(因一般用右手画图),观察时要两眼同时睁开,不要睁一只闭一只,因为这样易于疲劳。为了训练学生习惯于两眼同时睁开观察,可剪一块长约14cm,宽约6cm的长方形硬纸片,在靠近左端处挖一个直径比镜筒上端外径略小的圆孔,把圆孔套在镜筒上段,观察时两眼同时睁开,利用纸片的右端挡住右眼的视线,这样训练一段时间后,就能习惯于两眼同时睁开,然后把纸片去掉。

      2、直筒显微镜的镜臂与镜座连接处,是一个机械关节,可用于调节镜筒的倾斜度,便于观察,镜臂不能过于后倾,一般不超过40°。但是在使用临时装片观察时,禁止使用倾斜关节(当镜筒倾斜时,载物台也随之倾斜,载玻片上的液体易流出),尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用,以免污损镜体。

      3、目镜和物镜的使用

      一般都是用一个放大倍数适中的目镜(10×)和zui低倍的物镜开始观察,逐步改用倍数较高的物镜,从中找到符合实验要求的放大倍数。

      转换物镜时,先用低倍镜观察,调节到正确的工作距离(成像zui清晰)。如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。低倍物镜和高倍物镜基本齐焦(同高调焦),在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动细准焦螺旋进行调节。

      通常认为,使用任何一个物镜时,有效放大倍数的上限是1000乘它的数值孔径,下限是250乘它的数值孔径。如40×物镜的数值孔径是0.65,则上、下限分别为:1000×0.65=650倍和250×0.65163倍,超过有效放大倍数上限的叫做无效放大,不能提高观察效果。低于下限的放大倍数则人眼无法分辨,不利于观察。一般zui实用的放大倍数范围是500700乘数值孔径之间的数字。

       

      4、油浸物镜的使用

      使用油浸物镜时,一般不要使用同高调焦。同高调焦只适用于每台显微镜的原配物镜,在使用低倍和高倍物镜时,是一个极有利的方便条件,但在使用油浸物镜时,则受到一定限制,一般地说,用油镜观察未加盖玻片的标本片(载玻片)时,利用同高调焦的安全度较大,而对于有盖玻片的标本片,要小心使用,因为油浸物镜的工作距离很短,在设计和装配时所考虑的同高是对标准厚度盖玻片的。

      用油浸物镜时,只在标本片上滴香柏油。观察完毕后,要及时进行清洁工作,如不及时进行,香柏油粘上灰尘,擦拭时灰尘粒子可能磨损透镜,香柏油在空气中暴露时间长,还会变稠、变干,擦拭很困难,对仪器很不利。擦拭要细心,动作要轻。油浸物镜前端先用干的擦镜纸擦一两次,把大部分油去掉,再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次,zui后再用干的擦镜纸擦一次。标本片上的香柏油可用“拉纸法”(即把一小张擦镜纸盖在香柏油上,然后在纸上滴一些二甲苯,趁湿把纸往外拉,这样连续三四次,即可干净,一般不会损坏未加盖玻片的涂片标本)擦净。擦镜纸也要防尘,一般在使用前,将每页剪成8小块,贮存在一个干净的小培养皿中,用起来既节省又方便。

       

      5、聚光器的使用方法

       

      ①、使用聚光器的原因

      当放大倍数增加时,一方面由于放大倍数越高,透镜数目越多,被透镜吸收的光线也越多;另一方面由于视场(指的是所能看到被检标本的范围)的亮度与放大倍数的平方成反比,即放大倍数越高,视场越暗。为了得到足够的亮度,必须安装聚光器,把光线集中到所要观察的标本上。

       

      ②、观察时聚光器应处的高度

      观察时,要保证得到zui好的观察效果,聚光器的聚光焦点应正好落在标本上。要实现这个条件,就必须调节聚光器的高度。当用平行光照明时,聚光器的聚光焦点是在它上端透镜平面中心上方约1.25mm之处,因此,人们常常要求在观察时将聚光器上升到它上端透镜平面仅稍稍低于载物台平面的高度,这样聚光焦点就可能落到位于标准厚度载玻片上的标本上。当使用比标准厚度薄的载玻片来承放标本时,聚光器的位置要相应地降低一些,而当使用过厚地载玻片时,聚光焦点只能落在标本下方,不利于精细的观察。

       

      ③、聚光器与物镜的配合

       

      这里所谓的配合,就是使聚光器和物镜这两者的数值孔径取得一致,以更好的进行较为精细的观察。假如聚光器的数值孔径低于物镜,那物镜的部分数值孔径就浪费了,从而达不到它的zui高分辨力。假如把聚光器的数值孔径大于物镜的数值孔径,则一方面不能提高物镜的规定分辨力,另一方面反会由于照明光束过宽,使物象的清晰度下降。聚光器与物镜配合的操作方法是:在完成照明、调焦操作后,取下目镜直接向镜筒中看,把聚光器下的可变光阑关到zui小,再慢慢地开大。开到它的口径与所见视场的直径恰好一样大,然后按上目镜,即可进行观察。每转换一次物镜,都要随着进行依次这样的配合操作。有的聚光器可变光阑的边框上刻有表示开启口径的尺度,可以根据刻度来进行配合。

       

      历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展;给人类的生活带来了的拓展。在提倡科技创新的今天,显微镜的使用已经成为中学生的一项基本技能,掌握结构,科学使用,良好维护,使之成为广大青少年探索未来世界的一个窗口。

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