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试剂盒提取DNA
  • 发布日期:2019-07-16      浏览次数:219
    • 基因组DNA提取试剂盒简介

      DNA是遗传信息的载体,是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验,获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提,因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中重要、基本的操作之一。

      Solarbio公司提供各种不同样品基因组DNA提取试剂盒,如植物、动物、细菌、细胞、血液、酵母等基因组DNA提取试剂盒。所提取的基因组纯度高,片段大小在50kb左右。用户可根据需要选用不同的试剂盒来进行不同样品的抽提。

       

      一、基因组DNA提取的原则

      1、保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中,故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。

      2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染,使下游试验顺利进行。

      二、基因组DNA提取的原理和方法

      DNA与组蛋白构成核小体,核小体缠绕成中空的螺旋管状结构,即染色丝,染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中,外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞,然后破碎胞膜及核膜,使染色体释放出来,同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。

      1、样品预处理

      从各种不同来源的样品(如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等)中提取高纯度的基因组DNA,因细胞结构及所成分不同,样品预处理方式也不同,以下简单介绍常用提取材料的预处理方式,若需详细了解,请参考本公司各基因组DNA提取试剂盒说明书。

      部分样品预处理方式

      植物材料液氮研磨

      动物材料匀浆、液氮研磨

      培养细胞蛋白酶K处理

      细菌溶菌酶破壁

      酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨

      血液红细胞裂解液去红细胞

      2、细胞裂解

      CTAB法:

      适用于植物组织、真菌等。

      CTAB是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(>0.7M NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

      SDS法:

      适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。

      SDS是一种阴离子去污剂,可溶解细胞膜,裂解细胞,使蛋白质变性、染色体解析。

      其它裂解方法:

      物理方式:机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等

      化学方式:异硫氰酸胍、碱裂解等

      酶法:蛋白酶K

      3、DNA分离纯化

      纯化要求:

      核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。

      其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到低程度。

      排除其它核酸分子的污染,如提DNA时应去除RNA,反之亦然。

      纯化方法:

      细胞破碎后,常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA,主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸DNA,使用方便、快捷,不需要使用有毒溶剂如酚、氯fang等,使得提取基因组像过滤一样简单,因此硅基质材料成为大规模分离纯化DNA的通用方法。

       

      硅基质材料吸附核酸的原理:主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合,在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构,形成阳离子桥,当盐被清除后,再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力,因而DNA从硅基质上被洗脱下来。

       

      注意事项:

      尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏。

      减少化学物质对DNA的降解,为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏,操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。

      防止基因组DNA的生物降解,主要是DNase降解基因组DNA,DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活,可用EDTA等金属离子螯和剂螯和Mg2+以抑制DNase的活性。

      减少物理因素对DNA的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等),细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂,DNase大量释放,样品反复冻融和高温等。

      4、DNA洗脱收集

      DNA的洗脱效率取决于以下重要因素:

      洗脱液成分:

      采用硅基质膜吸附的DNA,可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7。0-8。5之间洗脱效率较高,pH值低于7。0则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是TE(pH8。0),既为DNA从硅基质膜上洗脱下来提供良好的pH环境,其中的EDTA又能保证DNA不被DNase降解,同时由于EDTA浓度非常低,对核酸内切酶、DNA聚合酶的影响非常微弱,不影响后续试验,可放心使用。

      洗脱液体积:

      当洗脱液体积小于30ul时,洗脱效率很低且不稳定;当洗脱液体积在50-200ul时,洗脱效率稳定在80-90﹪,并可保证得到大产量,因此洗脱液体积不能小于30ul。

      加洗脱液部位:

      100-200ul洗脱液能完全覆盖硅基质膜,DNA的洗脱量可得到保证,但当洗脱液体积较少如30-50ul时,须在硅基质膜中间部分悬空滴加洗脱液,以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。

      洗脱液的温度:                                                

      在加洗脱液之前,先将洗脱液在60-75℃水浴中预热10分钟,可有效提高DNA的洗脱效率。

      洗脱时间和次数:

      加入预热的洗脱液后,可在室温放置2-5分钟使DNA完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。同时可进行二次或三次洗脱,即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、离心,使前次没有洗脱下来的DNA再次溶解在洗脱液里,从而提高DNA的产量。

      5、DNA的定量及检测

      提取得到的DNA片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测,从而判断DNA质量。

      用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量:

      得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。Solarbio公司的基因组DNA提取试剂盒提取的不同材料基因组DNA片段大小一般在50kb左右,能很好地满足后续试验的要求。

      通常用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量时,以溴酚蓝为示踪染料,EB染色,紫外观察,并与DNA分子量标准对照即可判断所提DNA的平均分子量。高质量的基因组DNA应显示为单一条带,如DNA降解则表现为弥散条带。

      用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度:

      浓度测定:

      DNA在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。

      以下简单介绍OD260的测定方法:

      所提基因组DNA样品=100ul

      进行OD260值测定的待测样品=20ul所提基因组DNA样品+180ul TE=200ul

      DNA稀释倍数=200ul/20ul=10倍

      如200ul待测样品OD260值=0。2

      待测样品浓度(即100ul基因组DNA样品浓度)=50ug/ml×OD260值×稀释倍数=100 ug/ml

      所提100ul基因组DNA样品总量=100 ug/ml×100ul=10ug DNA

      纯度测定:

      一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度。正常OD260/OD280值约为1.7-1.9,说明DNA纯度较好;若OD260/OD280值小于1.7,说明可能有蛋白污染;若OD260/OD280值大于2.0,说明可能有RNA污染或DNA已经降解。

      注:因为pH值和离子会影响光吸收值,因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,OD260/OD280值会偏低,但并不表示纯度低。

      6、DNA的储存

      储存溶液:

      DNA为两性解离分子,在碱性条件下较稳定,因此一般用TE(pH8。0)保存。TE的成分为:10 mM Tris-HCl(Tris与盐酸形成强的缓冲对);1 mM EDTA(乙二胺四乙酸,能螯合二价金属阳离子,抑制DNase的活性);pH8。0(碱性条件可减少DNA的脱氨作用,防止降解)。ddH2O的正常pH值为7。0,可作为DNA的储存液,但有些试验室制备的ddH2O呈酸性(pH值小于7。0),这不仅影响DNA的洗脱效率,而且导致长时间保存的DNA容易发生降解。因此建议用TE作为DNA的长期储存液。

      储存条件:

      为避免DNA降解,提取的DNA应先进行分装,然后置于-20℃或-70℃保存,同时注意避免反复冻融造成DNA降解。

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